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高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）的基本流程

2010-12-22

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）的基本流程
在“色譜原理”的相關(guān)章中已略述了HPLC與經(jīng)典的液相色譜之間的差異。經(jīng)典的液相色譜采用的固定相粒度范圍大，形狀不規(guī)則，分離的組分在術(shù)中擴(kuò)散厲害。同時(shí)，分離的組分在固定相中受到阻力大，滯留時(shí)間長(zhǎng)，譜帶加寬，分離效果差，而且每根色譜柱僅能分離一次樣品，消耗大。另外，經(jīng)典的液相色譜借助于流動(dòng)的重力或其它的簡(jiǎn)單裝置讓流動(dòng)相自上而下地流過(guò)色譜柱，又未能采用高靈敏度的檢測(cè)器，存在分析速度慢、靈敏度低的缺點(diǎn)。
用經(jīng)典的液相色譜分析氨基酸，近2m長(zhǎng)，1cm粗的玻璃柱，固定相為離子交換樹脂，用去流動(dòng)相近1000mL,花費(fèi)20h分離了20種氨基酸。繼而英國(guó)科學(xué)家馬廷用一根30cm長(zhǎng)的玻璃柱，液-液分配色譜方法分離子氨基酸。為此他獲得了1952年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
有HPLC分離氨基酸，20cm長(zhǎng)，4.6mm內(nèi)徑的不銹鋼柱，內(nèi)填0.7um的HPLC用的固定相，僅30min，用去流動(dòng)相15mL分離出近20種氨基酸。
神奇的HPLC神奇在哪里？
這種神奇在于固定相，也稱HPLC填料。HPLC采用5 ~ 10um小顆粒的球形填料，常用的是球形硅膠，無(wú)論是鍵合的，還是未鍵合的，都有一定的孔徑和較大的比表面積，粒度很均勻。
一根25cm長(zhǎng)，內(nèi)徑為4.6mm的HPLC柱可達(dá)數(shù)萬(wàn)個(gè)理論塔片，比經(jīng)黃的液相色譜柱高出3—4個(gè)數(shù)量級(jí)的柱效，可分離上百個(gè)組分。因分辨率高，在一長(zhǎng)色譜圖上可容納很多的色譜峰。
HPLC填料除了顆粒細(xì)、阻力小、傳力快、分離效果好外，還有各種不同性能的填料，為分離各種性能不同的組分提供了條件。
HPLC的色譜柱是封閉式、小尺寸，在同一根色譜柱可反復(fù)進(jìn)樣品數(shù)百次分析測(cè)定，配上性能優(yōu)良的高壓輸液泵，使流動(dòng)相快而穩(wěn)定地通過(guò)色譜柱，分析速度快，結(jié)果更準(zhǔn)確。
HPLC的高壓部分處于全封閉狀態(tài)，從進(jìn)樣到檢測(cè)組裝在一個(gè)系統(tǒng)中，減少了對(duì)環(huán)境的污染，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和半自動(dòng)化操作，更省力省時(shí)。
由于以上種種優(yōu)點(diǎn)，HPLC更適合于高沸點(diǎn)、大分子、極性強(qiáng)和熱穩(wěn)定性差的組分的分離和分析，所以HPLC獲得廣泛的用途。
1、HPLC裝流動(dòng)相的儲(chǔ)液器
HPLC的儲(chǔ)液器用200—1000mL的優(yōu)質(zhì)玻璃瓶或者石英瓶。注意保持儲(chǔ)液器的清潔，除了定期清洗外，每次更換新的流動(dòng)相前都要清洗掉原使用的流動(dòng)相殘留。新配好的流動(dòng)相要在特制的抽濾瓶中抽濾掉可能損壞泵和污染色譜柱的雜質(zhì)顆粒，可部分抽去溶解于流動(dòng)相中的空氣。
脫氣很重要，因?yàn)槿芙庥诹鲃?dòng)相中的空氣會(huì)影響色譜系統(tǒng)的性能：在泵中聚積氣泡使壓力不穩(wěn)致流速不穩(wěn)，氣泡進(jìn)入檢測(cè)器會(huì)吸附在檢測(cè)器池壁上，增加檢測(cè)器噪聲，降低靈敏度甚至信號(hào)消失。流動(dòng)相中有O2對(duì)光電檢測(cè)器的影響大，使紫外檢測(cè)器的基流增大，在低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)信號(hào)被子低消掉。在熒光檢測(cè)器中O2會(huì)熄滅組分的熒光，降低靈敏度。在還原型的電化學(xué)檢測(cè)器中存在O2會(huì)阻撓反應(yīng)的進(jìn)行。
用水配制的流動(dòng)相極易溶解進(jìn)空氣能達(dá)到飽和狀態(tài)，而無(wú)水的流動(dòng)相（正相色譜）不存在這個(gè)問(wèn)題。
抽濾法脫氣只是暫時(shí)性的，使用過(guò)程中空氣又溶入流動(dòng)相，有效的方法為在線氦脫氣。氦不溶于流動(dòng)相，將氦緩緩地通往流動(dòng)相能趕出溶入的空氣，通氦10min可除去80% ~ 90%溶入的氣體，效果極佳。繼續(xù)地通入小流量的氦氣可防止空氣再溶入和反擴(kuò)散。
有一個(gè)典型的例子，可以看到空氣對(duì)紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器的影響，以可以看到氦脫氣后的效果。用反相色譜方法，固定相為C8鍵合相填料，流動(dòng)相為水-乙腈，測(cè)定組分為萘。開始氦脫氣，萘在紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器的出峰信號(hào)正常。停止氦脫氣，紫外檢測(cè)器的基線抬高，熒光檢測(cè)器的信號(hào)變小。再開始氦脫氣，兩個(gè)檢測(cè)器的信號(hào)慢慢恢復(fù)正常。
2、 HPLC的輸液泵
曾經(jīng)有多種類型的HPLC輸液泵。這里僅介紹目前常用的往復(fù)式恒流柱塞泵。
這種泵主要由人造寶石的柱塞桿、人造寶石單向閥和密封墊圈等組成，接在發(fā)動(dòng)機(jī)上的凸輪驅(qū)動(dòng)有彈簧裝置的柱塞桿來(lái)回運(yùn)動(dòng)。
進(jìn)口單向閥安裝在泵的底部，出口單向閥同向安裝在泵的上部，這樣有利于氣泡的排出。安裝在流動(dòng)相進(jìn)口端，寶石座與落下的寶石球成切線密封，寶石球彈起時(shí)又為篩網(wǎng)所擋。密封墊圈是用聚合物加耐磨物質(zhì)制成的。密封墊圈質(zhì)軟，外側(cè)緊緊地嵌在泵體中，內(nèi)側(cè)緊緊地包裹住光滑的人造寶石桿。因柱塞桿不斷運(yùn)動(dòng)，密封墊圈需要經(jīng)常更換，屬正常消耗品。
吸進(jìn)流動(dòng)相當(dāng)凸輪漸漸脫離柱塞桿，因彈簧作用，柱塞桿由泵腔向外運(yùn)動(dòng)，泵腔壓力較低，進(jìn)口單向閥的寶石球彈起來(lái)，而相同方向的出呂單向閥的寶石球在大氣壓力的作用下緊緊與閥座相切而密封。流動(dòng)相不斷流入泵腔中。
排出流動(dòng)相凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)一周后又漸漸擠緊柱塞桿，迫使用權(quán)柱塞桿向泵腔內(nèi)運(yùn)動(dòng)，進(jìn)口單向閥關(guān)閉，出口單向閥打開，流動(dòng)相被打入色譜柱內(nèi)。
若是用一個(gè)單柱塞泵吸液和排液脈沖很大。為了減小脈沖可用雙泵式柱塞泵，一個(gè)泵吸液，另一個(gè)泵排液，兩泵相關(guān)180°，加上流速調(diào)節(jié)器和壓力傳感器，可使壓力變化更和諧，運(yùn)動(dòng)曲線近似一條直線。
流動(dòng)相經(jīng)高壓泵輸液后進(jìn)入進(jìn)樣器，再到色譜柱和檢測(cè)器，這部分均呈密封高壓狀態(tài)，所有部件要能承受5—15MPa或更高的壓力，其管道和接頭都是耐壓的不銹鋼材料。
3、HPLC的進(jìn)樣器
GC可以采用柱頭進(jìn)樣器進(jìn)樣，因?yàn)镚C的壓力小，只要有一定的進(jìn)樣技巧就可以獲得良好的分析結(jié)果。而在HPLC中采用柱頭方式進(jìn)樣，因在高壓狀態(tài)下困難很大，難以獲得精確的結(jié)果。
六能平面進(jìn)樣閥是HPLC理想的進(jìn)樣器，在HPLC系統(tǒng)中的位置所示。
六能平面進(jìn)樣閥的主要部件是閥的后蓋不銹定子和用高聚物復(fù)合材料制成的轉(zhuǎn)子。轉(zhuǎn)子耐磨而密封性能好，緊緊壓在定子上。定子有六個(gè)均勻的小孔，孔與孔之間的夾角為60°，可以先看一看定子通道的連接法：孔1進(jìn)樣，孔2排出多余樣品，；孔3、孔6連接定量的樣品管；孔4接泵；孔5到色譜柱。
六能平面進(jìn)樣閥有兩種方式：外裝式進(jìn)樣和內(nèi)裝式進(jìn)樣，定子一樣，區(qū)別在轉(zhuǎn)子的導(dǎo)槽上。內(nèi)裝式進(jìn)樣死體積小，樣品用量少，多采內(nèi)裝式六能平面進(jìn)樣閥。但有時(shí)需要在線分析或自動(dòng)化分析還是要用外裝式六通平面進(jìn)樣閥。
4、HPLC的色譜柱
術(shù)是HPLC系統(tǒng)的心臟部件，許多分離問(wèn)題都?xì)w于柱。根據(jù)要分離的理化性質(zhì)決定用什么樣的色譜柱，也就確定了采用何種色譜方法。

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